<p class="ql-block">膠體金與不同細(xì)菌結(jié)合 與拉曼結(jié)合</p> <p class="ql-block">膠體金的制備主要包括兩個(gè)核心步驟：膠體金溶膠的合成和蛋白質(zhì)的標(biāo)記。根據(jù)目標(biāo)粒徑和實(shí)驗(yàn)室條件的不同，可以采用不同的方法。</p><p class="ql-block">下面為你整理了幾種常用的制備方法及其關(guān)鍵參數(shù)。</p><p class="ql-block">一、常用膠體金制備方法對(duì)比</p><p class="ql-block">1. 檸檬酸三鈉還原法（最常用）</p><p class="ql-block">· 原理與特點(diǎn)：通過(guò)加熱氯金酸(HAuCl?)水溶液，并加入檸檬酸三鈉作為還原劑，控制金顆粒的成核與生長(zhǎng)。操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好。</p><p class="ql-block">· 典型粒徑與顏色：通過(guò)改變還原劑的加入量，可以方便地制備15nm（橙紅色）到近150nm（藍(lán)灰色）不同粒徑的膠體金。</p><p class="ql-block">· 關(guān)鍵步驟：將0.01%氯金酸水溶液加熱至沸騰，在快速攪拌下一次性加入一定量的1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸并冷卻即可。例如，制備41nm膠體金，可在100ml氯金酸中加入1ml還原劑。</p><p class="ql-block">2. 檸檬酸三鈉-鞣酸混合還原法</p><p class="ql-block">· 原理與特點(diǎn)：利用混合還原劑在60℃的水浴中反應(yīng)，無(wú)需煮沸。通過(guò)調(diào)節(jié)鞣酸用量來(lái)控制粒徑。</p><p class="ql-block">· 典型粒徑與顏色：常用于制備粒徑較小的膠體金，均勻度可能更好。</p><p class="ql-block">· 關(guān)鍵步驟：將預(yù)熱的氯金酸溶液與含有檸檬酸三鈉、鞣酸和碳酸鉀的還原劑溶液混合，在60℃下反應(yīng)至顏色變深紅。</p><p class="ql-block">3. 白磷還原法</p><p class="ql-block">· 原理與特點(diǎn)：可制備約6nm、均勻度極佳的小粒徑膠體金。</p><p class="ql-block">· 注意事項(xiàng)：因使用易燃易爆的白磷乙醚溶液，對(duì)操作安全要求極高，一般實(shí)驗(yàn)室不建議采用。</p><p class="ql-block">4. 晶種生長(zhǎng)法（專(zhuān)利方法）</p><p class="ql-block">· 原理與特點(diǎn)：先制備小粒徑膠體金作為“晶種”，再通過(guò)緩慢加入氯金酸和另一種還原劑使晶種均勻長(zhǎng)大。</p><p class="ql-block">· 主要優(yōu)勢(shì)：此法能更好地控制粒徑和顆粒的球形度，從而提高標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。</p><p class="ql-block">二、膠體金的蛋白質(zhì)標(biāo)記</p><p class="ql-block">制備出膠體金溶膠后，需要將蛋白質(zhì)（如抗體）標(biāo)記到金顆粒表面，才能用于檢測(cè)。</p><p class="ql-block">1. 關(guān)鍵準(zhǔn)備步驟</p><p class="ql-block">· 器皿清潔：所有玻璃器皿必須徹底清潔，常用王水浸泡或硅化處理，以防雜質(zhì)干擾。</p><p class="ql-block">· 蛋白質(zhì)預(yù)處理：標(biāo)記前，蛋白質(zhì)需用低離子強(qiáng)度的水或緩沖液透析，以去除鹽分等干擾物質(zhì)。</p><p class="ql-block">2. 確定最佳標(biāo)記條件</p><p class="ql-block">標(biāo)記成功的關(guān)鍵在于找到穩(wěn)定膠體金所需的最適蛋白量，常用NaCl滴定法來(lái)確定：</p><p class="ql-block">· 將一系列梯度稀釋的蛋白溶液分別與固定量的膠體金混合。</p><p class="ql-block">· 加入高濃度NaCl溶液挑戰(zhàn)其穩(wěn)定性。</p><p class="ql-block">· 能使膠體金保持紅色不發(fā)生聚沉（變藍(lán)或變紫）的最小蛋白量，即為最小穩(wěn)定量。實(shí)際標(biāo)記時(shí)，通常在此基礎(chǔ)上增加10%的用量。</p><p class="ql-block">3. 正式標(biāo)記與純化流程</p><p class="ql-block">確定條件后，正式的標(biāo)記流程通常遵循以下步驟：</p><p class="ql-block">· 調(diào)節(jié)pH：用碳酸鉀（K?CO?）或鹽酸（HCl）將膠體金溶液的pH調(diào)節(jié)至略高于待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（通常pH 8.0-9.0），此時(shí)結(jié)合最牢固。</p><p class="ql-block">· 加入蛋白：在攪拌下，將計(jì)算好量的蛋白質(zhì)溶液逐滴加入膠體金中，室溫反應(yīng)。</p><p class="ql-block">· 加入穩(wěn)定劑：先后加入牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇（PEG）作為穩(wěn)定劑，封閉金顆粒表面剩余位點(diǎn)。</p><p class="ql-block">· 離心純化：通過(guò)超速離心去除未結(jié)合的游離蛋白質(zhì)，收集疏松的暗紅色沉淀。</p><p class="ql-block">· 重懸保存：將沉淀重懸于含穩(wěn)定劑的緩沖液中，于4℃避光保存。</p><p class="ql-block">三、制備過(guò)程的核心注意事項(xiàng)</p><p class="ql-block">為確保實(shí)驗(yàn)成功，有幾個(gè)要點(diǎn)需要特別注意：</p><p class="ql-block">· 水質(zhì)與試劑：實(shí)驗(yàn)必須使用雙蒸水或超純水。氯金酸易潮解、腐蝕金屬，稱(chēng)取時(shí)避免使用金屬藥匙。</p><p class="ql-block">· 鹽離子控制：整個(gè)標(biāo)記過(guò)程中，必須嚴(yán)格避免引入高濃度的鹽離子，否則會(huì)導(dǎo)致膠體金瞬間聚集沉淀。</p><p class="ql-block">· 粒徑與顏色：膠體金的粒徑直接決定其顏色和用途。例如，15-20nm（橙紅/紅色）的顆粒常用于免疫層析試紙條；更小的顆粒（<5nm）或更大的顆粒（>40nm）則可能用于電鏡或其他檢測(cè)。</p><p class="ql-block">四、如何根據(jù)需求選擇方法</p><p class="ql-block">你可以參考以下思路來(lái)選擇合適的方法：</p><p class="ql-block">· 如果你是初次嘗試或用于免疫層析試紙條開(kāi)發(fā)：建議從檸檬酸三鈉還原法開(kāi)始。它的操作成熟、重現(xiàn)性高，能制備適合層析的20-40nm膠體金。</p><p class="ql-block">· 如果你需要極?。s5nm）且均勻的顆粒：可以考慮晶種生長(zhǎng)法。但需注意，傳統(tǒng)的白磷還原法因危險(xiǎn)性高，不推薦常規(guī)使用。</p><p class="ql-block">· 如果你在標(biāo)記特定蛋白質(zhì)時(shí)遇到穩(wěn)定性問(wèn)題：需要重點(diǎn)優(yōu)化標(biāo)記pH和蛋白用量，并確保蛋白質(zhì)已充分透析。使用BSA和PEG進(jìn)行充分封閉至關(guān)重要。</p><p class="ql-block">如果你能告訴我你計(jì)劃使用膠體金的具體應(yīng)用場(chǎng)景（比如制作檢測(cè)試紙條，還是用于細(xì)胞成像），我可以為你提供更具體的建議。</p> <p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">免疫膠體金的制備及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記。同時(shí)在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生物芯片中都可能例用到。</p><p class="ql-block">1971年Faulk 和Taytor將膠體金引人免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于檢測(cè) HBsAg、HCG 和抗雙鏈ＤＮＡ抗體等，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。</p><p class="ql-block">免疫膠體金技術(shù)的基本原理</p><p class="ql-block">氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。</p><p class="ql-block">吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。</p><p class="ql-block">這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。</p><p class="ql-block">免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中，這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱(chēng)之為免疫金銀染色。</p><p class="ql-block">膠體金的制備方法</p><p class="ql-block">膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。下面介紹最常用的制備方法及注意事項(xiàng)。</p><p class="ql-block">１、玻璃容器的清潔：玻璃表面少量的污染會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，一切玻璃容器應(yīng)絕對(duì)清潔，用前經(jīng)過(guò)酸洗、硅化。硅化過(guò)程一般是將玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。專(zhuān)用的清潔器皿以第一次生成的膠體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸餾水淋洗，可代替硅化處理。</p><p class="ql-block">２、試劑、水質(zhì)和環(huán)境：氯金酸極易吸潮，對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱(chēng)盤(pán)。其１％水溶液在４℃可穩(wěn)定數(shù)月不變。實(shí)驗(yàn)用水一般用雙蒸餾水。實(shí)驗(yàn)室中的塵粒要盡量減少，否則實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將缺乏重復(fù)性。</p><p class="ql-block">金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測(cè)定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變，應(yīng)選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng)，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH3～5.8)、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5～10.3)等緩沖系統(tǒng)。但應(yīng)注意不應(yīng)使緩沖液濃度過(guò)高而使金溶膠自凝。</p><p class="ql-block">３、檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠：</p><p class="ql-block">取0、01％氯金酸水溶液100ml 加熱至沸，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入１％檸檬酸三鈉水溶液 0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在２分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸１５分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，如此制備的金溶膠其可見(jiàn)光區(qū)最高吸收峰在535nm。</p><p class="ql-block">Ａ1cm/535=1.12.金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顯著的顏色變化，這就是金溶膠用于免疫沉淀或稱(chēng)免疫凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)。</p><p class="ql-block">金溶膠顆粒的直徑和制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉量是密切相關(guān)的，保持其他條件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒徑的金溶膠，見(jiàn)附表。</p><p class="ql-block">附表 100 ml 氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對(duì)金溶膠粒徑的影響</p><p class="ql-block">１％檸檬酸三鈉ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00</p><p class="ql-block">金溶膠顏色 藍(lán)灰 紫灰 紫紅 紅 橙紅 橙</p><p class="ql-block">吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518</p><p class="ql-block">徑粒(nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15</p><p class="ql-block">４、檸檬酸三鈉－鞣酸混合還原劑：用此混合還原劑可以得到比較滿(mǎn)意的金溶膠，操作方法如下：取 4ml１％檸檬酸三鈉 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入0～5ml１％鞣酸，0～5ml 25mmo/L K2CO2（體積與鞣酸加入量相等）。</p><p class="ql-block">以雙蒸餾水補(bǔ)至溶液最終體積為20ml，加熱至60℃取1ml１％的 HAuCl4，加于79ml雙蒸餾水中，水浴加熱至60℃，然后迅速將上述檸檬酸－鞣酸溶液加入，于此溫度下保持一定時(shí)間，待溶液顏色變成深紅色(約需0.5～1小時(shí))后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰５分鐘即可。改變鞣酸的加入量，制得的膠體顆粒大小不同。</p><p class="ql-block">５、白磷還原法：在120ml雙蒸餾水中加入1.5ml１％氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一飽和度的白磷乙醚溶液，混勻后室溫放置15分鐘，在回流下煮沸 直至紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。此法制得的膠體金直徑約 6nm，并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實(shí)驗(yàn)室不宜采用。</p><p class="ql-block">要得到大小更均勻的膠體金顆粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度離心，經(jīng)分級(jí)后制得膠體金顆粒直徑的變異系數(shù)（ＣＶ）可小于１５％。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block">免疫膠體金制備</p><p class="ql-block">１、蛋白質(zhì)的處理：由于鹽類(lèi)成分能影響金溶膠對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對(duì)低離子強(qiáng)度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)絕對(duì)澄清無(wú)細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。</p><p class="ql-block">一般情況下應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因?yàn)樗鼈兌伎晌接陬w粒表面而減弱膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。</p><p class="ql-block">２、蛋白質(zhì)最適用量的選擇：將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質(zhì)5～40ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對(duì)照管，５分鐘后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置２小時(shí)，不穩(wěn)定的金溶膠將發(fā)生聚沉，能使膠體金穩(wěn)定的最適蛋白量再加10％即為最佳標(biāo)記蛋白量。</p><p class="ql-block">３、標(biāo)記：在接近并略為高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的條件下標(biāo)記是比較合適的，在此情況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大。</p><p class="ql-block">下述標(biāo)記步驟最為常見(jiàn)：</p><p class="ql-block">①用0、1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH(標(biāo)記ＳＰＡ?xí)r調(diào)到pH6.0)。</p><p class="ql-block">②于100ml 金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液（體積為２～３ml），攪拌２～３分鐘。</p><p class="ql-block">③加入5ml１％PEG20000溶液。</p><p class="ql-block">④于10000～100000g離心30～60分鐘（根據(jù)粒徑大小選擇不同離心條件），小心吸去上清液（切忌傾倒）。</p><p class="ql-block">⑤將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以 Ａ1cm/540nm=1.5左右為宜，以 0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4℃保存。</p><p class="ql-block">⑥包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G-200柱進(jìn)行凝膠層析分離純化，以含 0.1％ＢＳＡ的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2，以Ａ蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0.</p><p class="ql-block">以上操作中應(yīng)注意，一切溶液中不應(yīng)含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預(yù)處理。</p><p class="ql-block">膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存</p><p class="ql-block">膠體金具有很高的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時(shí)自身凝聚極慢，可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。</p><p class="ql-block">金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過(guò)高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。</p><p class="ql-block">當(dāng)金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取決于吸附蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，如ConA，過(guò)氧化物酶等，當(dāng)pH較低時(shí)保持穩(wěn)定，提高pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電點(diǎn)或略高時(shí)又變得穩(wěn)定了。</p><p class="ql-block">標(biāo)記后的膠體金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作為穩(wěn)定劑。在4～10℃貯存數(shù)月有效，不宜冰凍。貯存中可能會(huì)發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去。</p><p class="ql-block">免疫膠體金的應(yīng)用</p><p class="ql-block">１、膠體金在電鏡水平的應(yīng)用</p><p class="ql-block">膠體金應(yīng)用電鏡水平的研究最早，發(fā)展最快，應(yīng)用最廣泛。</p><p class="ql-block">其最大優(yōu)點(diǎn)是可以通過(guò)應(yīng)用不同大小的顆粒或結(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。直徑為3～15nm 膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。3～15nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測(cè)，而直徑15nm 多用于檢測(cè)量較多的感染細(xì)胞。</p><p class="ql-block">膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：①細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。②單層培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)。③組織抗原的檢測(cè)。</p><p class="ql-block">金標(biāo)記在電鏡水平的應(yīng)用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫負(fù)染色、雙標(biāo)記技術(shù)和原位雜交技術(shù)等。</p><p class="ql-block">實(shí)驗(yàn)證明，該法樣本用量少、檢測(cè)速度快、對(duì)比明顯、操作簡(jiǎn)單、敏感性和特異性高，既可用于抗原檢測(cè)，也可用于抗體檢測(cè)，因此，可同時(shí)適用于科研和診斷。</p><p class="ql-block">２、膠體金在光鏡水平的應(yīng)用</p><p class="ql-block">膠體金同樣可用做光鏡水平的標(biāo)記物，取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細(xì)胞涂片、切片均可應(yīng)用。主要用于：①用單克窿抗體或抗血清檢測(cè)細(xì)胞懸液或培養(yǎng)的單層細(xì)胞的膜表面抗原。②檢測(cè)培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原，③組織中或亞薄切片中抗原的檢測(cè)。</p><p class="ql-block">膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補(bǔ)其它標(biāo)記物不可避免的本底過(guò)高和內(nèi)部酶活性干擾等缺點(diǎn)。</p><p class="ql-block">３、膠體金在流式細(xì)胞儀中的應(yīng)用：</p><p class="ql-block">應(yīng)用熒光素標(biāo)記的抗體，通過(guò)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析細(xì)胞表面抗原，是免疫學(xué)研究中的重要技術(shù)之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊，區(qū)分不同的標(biāo)記困難，因此必須尋找一種非熒光素標(biāo)記物，用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。</p><p class="ql-block">這樣可以同時(shí)進(jìn)行幾種標(biāo)記。該標(biāo)記物必須能夠改變散射角，膠體金可以明顯地改變紅激光散射角，因而可以作為流式細(xì)胞儀的標(biāo)記物之一。</p><p class="ql-block">４、凝集試驗(yàn)：?jiǎn)畏稚⒌拿庖呓鹑苣z呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當(dāng)與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專(zhuān)一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，顆粒也會(huì)沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無(wú)色，這一原理可定性或定量地應(yīng)用于免疫反應(yīng)。</p><p class="ql-block">５、免疫印跡技術(shù)(immunoblotting)：免疫印跡是一種較新的免疫化學(xué)技術(shù)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后用酶免疫法（或免疫熒光、ＲＩＡ）進(jìn)行定量。</p><p class="ql-block">免疫膠體金也可用于該法的定量。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后，再與經(jīng)葡萄球菌Ａ蛋白致敏的膠體金溫育，徹底洗去多余的膠體金，根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測(cè)知樣品中的特異性抗原。</p><p class="ql-block">利用金顆?？纱呋y離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強(qiáng)金顆粒的可見(jiàn)性，更可大大提高測(cè)定靈敏度，檢測(cè)下限可低至 0.1ng，這種免疫金銀染色法應(yīng)用已日趨廣泛。</p><p class="ql-block">由于膠體金免疫印跡技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，且有相當(dāng)?shù)母叩撵`敏度，在臨床免疫診斷上有很大的應(yīng)用潛力。</p><p class="ql-block">６、膠體金在肉眼水平的應(yīng)用</p><p class="ql-block">膠體金取代傳統(tǒng)三大標(biāo)記物，用于肉眼水平的免疫檢測(cè)中。除了膠體金本身具有的特點(diǎn)外，還有以下優(yōu)點(diǎn)：</p><p class="ql-block">①試劑和樣本用量極小，樣本量可低至1～2ul；</p><p class="ql-block">②不需γ－計(jì)數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測(cè)儀等貴重儀器，更適于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用；</p><p class="ql-block">③沒(méi)有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與；</p><p class="ql-block">④實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以長(zhǎng)期保存；</p><p class="ql-block">⑤時(shí)間大大縮短，提高了檢測(cè)速度。金標(biāo)過(guò)程中，無(wú)共價(jià)鍵形成，是一定離子濃度下的物理吸附。</p><p class="ql-block">因此幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記，標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠體金的敏感性可達(dá)到 ELISA的水平。而結(jié)合銀染色時(shí)，檢測(cè)的敏感性更大大提高。</p><p class="ql-block">７、膠體金在免疫層析快速診斷技術(shù)中的應(yīng)用</p><p class="ql-block">免疫層析法(immunochromatography)是近幾年來(lái)國(guó)外興起的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體先固定于硝 酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用。</p><p class="ql-block">樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。</p><p class="ql-block">裝配方法：在塑料底板上分別將吸尿用玻璃纖維、凍干金標(biāo)記抗α－HCG玻璃纖維、已固定有抗β－HCG抗體的NC膜及硬質(zhì)吸水濾紙按圖裝配，配件與塑料底板的結(jié)合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成寬 度為4mm的條狀，即為尿妊用紙條。</p><p class="ql-block">本法檢測(cè)速度快，一般一兩分鐘可出結(jié)果；靈敏度高，可達(dá)50IU/L；好的試紙條結(jié)果也是準(zhǔn)確可靠的，這是其所以能在尿妊診斷中得到廣泛應(yīng)用的主要原因。尿妊試紙條的快速特性來(lái)源于膠體金免疫層析法的固有特性，但與原材料選擇特別是NC膜的孔徑大小密切相關(guān)，準(zhǔn)確性取決于抗β－HCG的特異性。</p><p class="ql-block">金標(biāo)尿妊紙條雖然好用，但在使用中也必須注意以下幾個(gè)方面：</p><p class="ql-block">一是溫度，試紙條雖然可在室溫保存，但大批暫時(shí)不用的試紙條還是應(yīng)該放在４℃保存，以免抗體失效，從冰 箱剛?cè)〕龅脑嚰垪l則應(yīng)待其恢復(fù)至室溫，然后才打開(kāi)密封，可避免反應(yīng)線(xiàn)模糊不清。</p><p class="ql-block">二是正確操作，一般的操作方法是在試紙條的吸尿玻璃端滴入２滴（約１００微升）尿液，或?qū)⑽蚨酥苯硬迦霕?biāo)本中，深度約１０～１５毫米２０秒，取出后平放，這種方法比較麻煩且容易造成污染。我們的方法是取尿標(biāo)本約0.5ml 加入小試管中，然后插入試紙條，待１～２分鐘反應(yīng)帶清晰后觀察結(jié)果。</p><p class="ql-block">８、膠體金在快速斑點(diǎn)滲濾技術(shù)中的應(yīng)用</p><p class="ql-block">ＥＬＩＳＡ法在臨床實(shí)驗(yàn)室已得到普遍的應(yīng)用，特別是用于各型肝炎標(biāo)志物的檢測(cè)。但ＥＬＩＳＡ法由于操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，給實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)不便。因此出現(xiàn)一步法快速檢測(cè)試劑盒，雖可提高檢測(cè)速度，但有出現(xiàn)假陰性結(jié)果的弊端。</p><p class="ql-block">ＥＬＩＳＡ法需時(shí)較長(zhǎng)的主要原因，是由于液相中的抗原（或抗體）需經(jīng)擴(kuò)散才能與固相上的抗原或抗體反應(yīng)不適當(dāng)?shù)乜s短反應(yīng)時(shí)間，將使靈敏度降至臨床要求以下。</p><p class="ql-block">為滿(mǎn)足臨床快速檢測(cè)的需要，近年來(lái)發(fā)展了多種簡(jiǎn)便、快速的免疫學(xué)檢測(cè)方法，快速斑點(diǎn)滲濾法即為其中一種，其標(biāo)記物質(zhì)用膠體金即稱(chēng)為快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法Dot-immunogold filtration assay)，又稱(chēng)滴金免疫法。</p><p class="ql-block">快速斑點(diǎn)滲濾法的基本原理仍是間接法或夾心法。間接法測(cè)抗體：固定于膜上的特異性抗原＋標(biāo)本中的相應(yīng)抗體＋金標(biāo)記的抗抗體或ＳＰＡ顯色。夾心法測(cè)抗原：固定于膜上的多克隆抗體＋標(biāo)本中待測(cè)抗原＋金標(biāo)記的特異性單克隆抗體顯色。</p><p class="ql-block">結(jié)果判斷：快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法在操作完成后即可直接觀察結(jié)果。根據(jù)測(cè)定模式的不同可有以下不同的判定結(jié)果。</p><p class="ql-block">快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)速度快，結(jié)果觀察一目了然，已應(yīng)用于多種臨床檢測(cè)項(xiàng)目。</p><p class="ql-block">以上分析可以看出，膠體金標(biāo)記技術(shù)是繼三大標(biāo)記技術(shù)之后，又一較為成熟且已得到廣泛應(yīng)用的免疫標(biāo)記技術(shù)。</p> <p class="ql-block">要讓膠體金的尺寸在制備后保持穩(wěn)定，核心是阻止顆粒的進(jìn)一步生長(zhǎng)或聚集。這需要在制備、儲(chǔ)存和后續(xù)處理的全過(guò)程中，控制多個(gè)關(guān)鍵因素。</p><p class="ql-block">下表匯總了確保膠體金尺寸穩(wěn)定的主要控制要點(diǎn)：</p><p class="ql-block">控制環(huán)節(jié) 關(guān)鍵目標(biāo) 具體操作與原理</p><p class="ql-block">制備過(guò)程控制 確保單分散性，減少多分散顆粒 迅速混合：還原劑加入氯金酸時(shí)需劇烈攪拌，確保成核瞬間完成。 精準(zhǔn)控溫/時(shí)間：加熱法制備需確保溶液快速達(dá)到沸騰，反應(yīng)時(shí)間一致。 試劑純凈：使用超純水（18.2 MΩ·cm），試劑（如氯金酸、檸檬酸三鈉）需高純度。</p><p class="ql-block">表面修飾與穩(wěn)定 提供靜電或空間位阻斥力 靜電穩(wěn)定：調(diào)節(jié)pH遠(yuǎn)離金顆粒等電點(diǎn)（約pH 3-4），使表面帶強(qiáng)負(fù)電荷相互排斥，常用硼酸緩沖液調(diào)至pH 8.5-9.5。 空間位阻穩(wěn)定：加入表面活性劑（如PEG-20000、Tween-20）或蛋白（如BSA），形成保護(hù)層。</p><p class="ql-block">儲(chǔ)存條件控制 避免環(huán)境因素導(dǎo)致聚集 潔凈容器：使用硅化或?qū)Ｓ枚栊匀萜鳎苊鈩澓畚健?低溫避光：于4℃冰箱避光儲(chǔ)存，禁止冷凍。 無(wú)菌過(guò)濾：長(zhǎng)期儲(chǔ)存可經(jīng)0.22 μm濾膜（水系、低蛋白吸附）除菌。</p><p class="ql-block">后續(xù)處理注意 防止在標(biāo)記、純化時(shí)失穩(wěn) 抗鹽離子：操作液保持低鹽濃度（<1 mM），或加入足量穩(wěn)定劑。 輕柔操作：避免劇烈渦旋、反復(fù)凍融，離心純化時(shí)采用推薦轉(zhuǎn)速。</p><p class="ql-block">??? 尺寸穩(wěn)定性的進(jìn)階策略</p><p class="ql-block">對(duì)于要求更高的應(yīng)用（如生物標(biāo)記、高端傳感器），可以采取以下策略：</p><p class="ql-block">· 使用雙穩(wěn)定機(jī)制：結(jié)合靜電排斥和空間位阻。例如，在用BSA標(biāo)記抗體后，再加入少量PEG進(jìn)行二次封閉，效果更佳。</p><p class="ql-block">· 精確控制粒徑分布：如果出現(xiàn)多分散（尺寸不一）的情況，可通過(guò)梯度離心或凝膠電泳進(jìn)行尺寸篩選，收集單分散性最好的部分。</p><p class="ql-block">· 選擇專(zhuān)有穩(wěn)定劑：市場(chǎng)上有針對(duì)膠體金穩(wěn)定性的商業(yè)化穩(wěn)定緩沖液，它們經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可以提供更好的保護(hù)。</p><p class="ql-block">?? 判斷是否失穩(wěn)的簡(jiǎn)易方法</p><p class="ql-block">觀察是判斷膠體金是否穩(wěn)定的最直接方法：</p><p class="ql-block">· 穩(wěn)定狀態(tài)：液體澄清，顏色均一（如亮紅色、酒紅色或藍(lán)灰色，取決于粒徑），無(wú)沉淀，瓶壁無(wú)金色金屬膜附著。</p><p class="ql-block">· 失穩(wěn)跡象：液體顏色變深發(fā)紫或變藍(lán)，出現(xiàn)絮狀物或沉淀，透光性變差。</p><p class="ql-block">一旦出現(xiàn)失穩(wěn)跡象，通常難以逆轉(zhuǎn)，需要重新制備。</p><p class="ql-block">?? 關(guān)鍵行動(dòng)建議</p><p class="ql-block">綜合來(lái)看，你可以按以下優(yōu)先級(jí)采取行動(dòng)：</p><p class="ql-block">1. 立即檢查：首先檢查你的膠體金溶液是否避光、低溫（4℃）儲(chǔ)存，并觀察顏色和沉淀情況。</p><p class="ql-block">2. 優(yōu)化配方：如果穩(wěn)定性反復(fù)出問(wèn)題，重點(diǎn)檢查pH值和穩(wěn)定劑。確保標(biāo)記或保存的pH高于8.5，并添加了足量的BSA/PEG作為穩(wěn)定劑。</p><p class="ql-block">3. 控制環(huán)境：所有操作在潔凈環(huán)境中進(jìn)行，使用超純水和經(jīng)過(guò)處理的容器。</p><p class="ql-block">如果你能告訴我你制備膠體金的具體方法（如檸檬酸三鈉法）、目標(biāo)粒徑以及后續(xù)用途（如標(biāo)記抗體用于層析試紙），我可以為你提供更具針對(duì)性的穩(wěn)定化方案。</p>